低溫狀態(tài)，細胞能否存儲，保持活性，有一個避不開的話題：冰晶。我們技術團隊很榮幸有機會聆聽清華大學曹海山副教授的研究團隊對于細胞低溫保存玻璃化技術的講座。

使用玻璃化技術的生物材料存活率會更高。在將生物材料冷卻時，經常使用冷凍保護劑（CPA）。

為了更好地理解玻璃化和結晶過程，清華大學曹海山副教授的研究團隊通過使用高速顯微鏡、相機和拉曼光譜儀，報告了用不同濃度的二甲基亞砜（DMSO）溶液冷凍保護的洋蔥表皮細胞的結晶和玻璃化的動態(tài)過程。

在實驗中使用的低溫顯微鏡系統(tǒng)主要包括一個生物顯微鏡，配備了一個冷卻臺和一個高速相機。冷卻臺的溫度由Linkam控制器調節(jié)，從-196℃到100℃，精確度為0.01℃。冷卻或升溫的速度可以在0.01℃/min到130℃/min的范圍內控制。

研究者用低溫顯微鏡觀察到了冷卻過程中細胞內和細胞外液的五種結晶和玻璃化現(xiàn)象。

在冷卻速度為10℃/min至130℃/min的情況下，0-30%DMSO溶液中的細胞都會結晶。對于浸泡在0-20%DMSO溶液中的細胞，冰晶首先在觀察區(qū)外的細胞外空間形成核。冰晶的生長和傳播到觀察區(qū)，直到該區(qū)結晶，對于浸泡在30%DMSO溶液中的細胞，細胞內冰晶的傳播先于細胞外冰晶的傳播（圖1A-1B）。

圖1A-1B

單個細胞中胞內冰晶的形成有三種模式（圖1C），模式一，冰晶的生長從細胞一側的成核點開始，然后向細胞內傳播。模式II，冰晶的生長從細胞兩邊的兩個成核點開始，然后傳播到細胞的中心。模式III，冰晶的生長從細胞內的一個成核點開始，然后傳播到細胞的邊界。

圖1C

細胞外結晶和細胞內玻璃化 

以130℃/min的冷卻速度，浸泡在40%DMSO溶液中的細胞冷卻到-140℃，細胞內的液體被玻璃化。然而，非晶相不是純粹的玻璃狀固體，而是嵌入玻璃狀基質的納米/微晶域（圖3）。

細胞外和細胞內的玻璃化作用  

在冷卻速度為1℃/min的冷卻過程中，浸泡在50-70%DMSO溶液中的細胞的細胞內和細胞外液都轉變?yōu)榫哂屑{米/微晶域的玻璃基質（圖4A）。隨著溫度從-50℃降到-140℃，浸泡在50%DMSO溶液中的細胞，納米/微晶域的晶體面積分數從0%增加到6.6%（圖4B）。當細胞從室溫冷卻到-140℃時，晶體面積分數從高到低依次是浸泡在50%、70%和60%DMSO溶液中的細胞。因此，并不是DMSO濃度越高，低溫保存就越有效。

當細胞從室溫冷卻到-140℃時，隨著冷卻速率的增加，晶體面積分數下降（圖4C）。

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